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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 728–733
CN 31-1300/Q |
Knockout
of tyrR Gene in Escherichia coli and Its Effects on the
Phenylalanine Biosynthesis
SHANG
Liang, FAN Chang-Sheng*, JIN Rui-Liang,
LIU Dong-Xin, WANG Jian-Gang, YIN Jun, SONG Da-Xin
( Department of Microbiology,
School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433,China )
Abstract TyrR is a global regulation protein encoded by tyrR gene which
controls several transcriptional units involving biosynthesis and
transportation of aromatic amino acids in Escherichia coli. In this work, the
tyrR gene was knocked out by a double-cross homologous recombination. The tyrR－ mutant was verified by structural
identification by PCR and sequencing, and functional demonstration using lacZ reporter
gene. In tyrR－ mutant, the activities of two
key enzymes in the phenylalanine biosynthesis pathway, whose expression was
controlled by TyrR, DAHPS and AT, had been shown to elevate by a 1.08-fold and
2.70-fold compared with the parent strain, respectively. The yield of
phenylalanine biosynthesis in the mutant was 1.59 times higher than that of
wild type strain. The repression on the transcription of aroP, encoding an
aromatic amino acid permease, was eliminated, resulting in a 70.2% increase of
the aromatic amino acid transportation in tyrR－
mutant strain.
Key
words tyrR; gene knockout;
phenylalanine biosynthesis; metabolic regulation; Escherichia coli
_________________________________________
Received:
April 14, 2003 Accepted:
May 23, 2003
This
work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of
China (No. 30070020)
*Corresponding
author: Tel, 86-21-65642808; Fax, 86-21-65650149; e-mail, [email protected]
大肠杆菌tyrR基因剔除及其对苯丙氨酸生物合成的影响
商量 范长胜* 金瑞良 刘东信 王建刚 尹隽 宋大新
( 复旦大学生命科学学院微生物学系, 上海 200433 )
摘要 TyrR是大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成和运输途径中的一种全局性调控蛋白质。 采用双交换同源重组的方法定位突变大肠杆菌染色体tyrR基因,
在该基因中插入带有卡那霉素抗性基因的DNA片段, 使之失活,
实现基因剔除。 经PCR、 DNA测序、
lacZ报告基因等多种方法证实了基因剔除的可靠性。 tyrR基因剔除后, 大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受TyrR蛋白调控的关键酶的酶活力有所提高： 3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS, 由aroG编码)酶活力提高了1.08倍, 转氨酶(AT,
由tyrB编码)酶活力提高了2.70倍; 突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高了1.59倍; 同时, 与芳香族氨基酸运输相关的通透酶基因aroP(P) 的阻遏被解除, 细胞运输芳香族氨基酸的能力提高了70.2%。
关键词 tyrR; 基因剔除; 苯丙氨酸生物合成; 代谢调控;
大肠杆菌
苯丙氨酸是人体的必需氨基酸之一, 在日常生活中用途广泛, 如用于抗癌制剂、 氨基酸输液、 食品添加剂、 甜味剂制作等。 目前市场所需的苯丙氨酸主要来源于微生物发酵法和酶法, 因此, 开展对苯丙氨酸的生物合成代谢途径及其调控机制的研究, 对于构建生产苯丙氨酸的基因工程菌株具有相当重要的意义, 同时对人类苯丙酮尿症治疗研究及生物工程药物筛选也具有潜在的价值。
微生物合成苯丙氨酸的途径长, 代谢调控复杂。 它与酪氨酸、 色氨酸之间的合成和调控相互联系又相互制约[1,2]。
本文报道的TyrR作为一种大肠杆菌芳香族氨基酸合成代谢中的全局性调控蛋白质, 控制着包括自身编码基因tyrR在内,
涉及苯丙氨酸、 酪氨酸、 色氨酸合成与运输的8个转录单元的转录[3,4]。
这些转录单元的共同特征是在其转录调控区内存在着数量为1～3个不等的,
保守结构为TGTAAAN6TTTACA的22 bp茎环结构,
称为TyrR盒[5]。
TyrR蛋白与这些TyrR盒结合实现对8个转录单元的调控。
当有酪氨酸存在时, TyrR蛋白抑制tyrB、
aroP、 aroL-aroM、 aroF-tyrA和tyrP的转录[6]; 体外试验表明这一过程需要ATP参与[7,8]。
TyrR蛋白对aroG和tyrR转录的抑制不需要酪氨酸参与[9,10]。 有苯丙氨酸存在时,
TyrR也可以抑制aroP[11]和tyrB[12]的转录,
对aroG的抑制作用也有增强[5]。 酪氨酸介导的TyrR的抑制作用的机制不同于苯丙氨酸介导的抑制作用, 前者是阻止开放启动子复合物的形成[13], 后者则阻止开放启动子复合物形成以后的下游事件发生[12]。 TyrR蛋白也有激活转录的功能,
受这种激活调控的基因是tyrP和mtr[14,15], 它们编码芳香族氨基酸的跨质膜运输蛋白质。 受TyrR激活的启动子为σ70 启动子,
TyrR 属于I类转录激活因子; 激活作用涉及TyrR与RNA聚合酶的α亚基的相互作用[16～18]。
对TyrR蛋白的研究, 国内尚无相关报道。
本研究运用基因打靶技术,
在大肠杆菌K12的tyrR基因中插入卡那霉素抗性基因(kanR)。 通过双交换同源重组将卡那霉素抗性基因整合在染色体的tyrR基因中[19],
导致tyrR基因正常功能丧失, 实现基因剔除,
与此同时又获得携带卡那霉素抗性基因(kanR)的突变菌株。 我们从基因结构和功能角度对该突变菌株的可靠性加以验证, 对比检测了突变菌株和野生型菌株苯丙氨酸生物合成途径中受TyrR蛋白调控的关键酶活力状况; 研究了剔除tyrR基因对苯丙氨酸生物合成与运输的影响。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒本研究中使用的菌株和质粒见表1。
Table 1 Strains and plasmids
|
Strains
and plasmids |
Characteristics
and function |
Resources* |
|
Escherichia
coli K12 |
Donor
for gene cloning |
L |
|
E.
coli DH5α |
Receptor
for transformation |
L |
|
E.
coli CSH60-31 |
recA+, wild type for knockout |
L |
|
E.
coli SL10 |
E.
coli CSH60-31
tyrR– |
W |
|
pBR322 |
ampR
tetR |
L |
|
pJN0 |
kanR
resource of kan2 |
L |
|
pSL4 |
ampR kanR recombination plasmid |
W |
|
pBAL |
ampR pBR322 carrying ParoP-lacZ |
W |
|
PBBL |
ampR pBR322 carrying PtyrB-lacZ |
W |
|
pBRL |
ampR pBR322 carrying PtyrR-lacZ |
W |
|
PBGL |
ampR pBR322 carrying ParoG-lacZ |
W |
|
PBP |
ampR pBR322 carrying aroP(P) |
W |
L,
obtained in this lab; W, obtained from this work.
1.1.2 酶类和主要生化试剂 限制性内切酶、
Taq酶和DNA连接酶购自TaKaRa公司;
酶活力测定试剂购自Sigma公司。
1.1.3 培养基和缓冲液 大肠杆菌培养和质粒增殖培养基 LB、
NB培养基和各抗生素用量参考文献[20]。
基本培养基(MM)： 20 g/L葡萄糖、 5 g/L (NH4)2SO4、
0.5 g/L KH2PO4、 0.5 g/L K2HPO4、 0.5 g/L MgSO4、 5 mg/L MnSO4、 5 mg/L FeSO4; 复合氨基酸(Lys、
Arg、 Met、 Cys、
Cyn、 His、 Gln、
Asp、 Thr各1 mmol/L); 复合维生素(5
mg/L生物素、 20 mg/L烟酰胺、 2 mg/L泛酸钙、
11 mg/L维生素B1、 15 mg/L维生素B2、 0.4 mg/L维生素B6);
过滤除菌。
发酵培养基：
50 g/L葡萄糖、 10 g/L酵母膏、 3 g/L Na2HPO4 、 1 g/L KH2PO4、 12 g/L NH4Cl、 1 g/L MgSO4、 0.3 g/L CaCl2、 6 g/L柠檬酸钠、
0.6 g/L谷氨酸钠、 2 g/L蛋白胨、 20 mg/L维生素B1,
pH 7.5; 0.07 MPa (10 lbf/in2); 灭菌20 min。
缓冲液X： 7.2 mmol/L K2HPO4、 2.8 mmol/L KH2PO4、 100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L EDTA, pH 7.4。
1.2 方法
1.2.1 DNA抽提和基因工程 操作参考文献[20]的方法完成;
DNA测序由联合基因公司完成。
1.2.2 PCR引物设计 委托上海博亚公司合成, 所使用的引物见表2。
1.2.3 同源重组子的筛选与稳定性测试 pSL4转化E. coli CSH60-31[延长温育时间为3 h, 使用卡那霉素(Kan)单抗LB平板培养],
于转化子中筛选ampS kanR菌落, 进行稳定性测试： 菌种分别接种于LB和含Kan的LB两种液体培养基中连续传代,
120代后, 利用平板菌落计数法比较两种培养物中Kan抗性菌落的数量。 抗生素用量： 氨苄青霉素(Amp)
100 mg/L; Kan 15 mg/L。
1.2.4 LacZ活性的测定 方法参考文献[20]的方法完成。
1.2.5 苯丙氨酸脱氨酶法测定苯丙氨酸含量 参考文献[21]的方法完成。
1.2.6 酶活力测定方法 (1)DHAPS和AT酶活性测定方法参考文献[22～24]的方法完成。
(2)苯丙氨酸吸收(运输)测定NB培养基扩增菌体(含质粒pBP的菌株需添加Amp), 缓冲液X洗涤两次, 取部分菌体测含水量,
另一部分菌体称重后用10 mL 5 mmol/L苯丙氨酸溶液(用缓冲液X配制)悬浮,
37 ℃、 250 r/min摇床培养, 每5
min取样一次, 离心, 取上清液,
利用苯丙氨酸脱氨酶法测定缓冲液中剩余的苯丙氨酸含量, 计算单位干重菌体30 min苯丙氨酸吸收量。
Table 2 Primers used in this study
|
Sequence
name |
DNA sequence of PCR primer* |
Enzyme site |
|
tyrR leader |
5'-CCCGAATTCTCCCATGCGTCTGGAAGTC-3' |
EcoRI |
|
3'-TTCACCTATACCGCTTGGGTTCGAAGCG-5’ |
HindIII |
|
|
tyrR tail |
5'-GCGGAATTCCGATATCAAAAGCAAAGTGGA-3’ |
EcoRI |
|
3'-TTCTCATTCGCGCTTATACCCTAGGGCG-5’ |
BamHI |
|
|
tyrR |
5'-CCCAAGCTTTCCCATGCGTCTGGAAGTC-3’ |
HindIII |
|
3'-TTCTCATTCGCGCTTATACGGACGTCAA-5’ |
PstI |
|
|
SEQ450 |
5’-AGATGCGTAAGGAGAAAATA-3’ |
– |
|
3’-ATAGAGTCAAGCCACATCCA-5’ |
– |
|
|
ZHA |
5’-GCGCTGCAGGATGACAAACCTCGCCTCG-3’ |
PstI |
|
3’-ATTACAGCCCGTTAGTCCATTCGAAGCG-5’ |
HindIII |
|
|
ZHB |
5’-GCGCTGAACAGCTATGACATGATTACG-3’ |
PstI |
|
3’-AGTCATGTCGGTCTCGACGAATTCGAAGCG-5’ |
HindIII |
|
|
aroP(P) |
5’-GCGGAATTCGCGACAATCTGGCGTTTTTCT-3’ |
EcoRI |
|
3’-GAGATGCGGGAGTGGGCATTCGAAGC-5’
|
HindII |
*
Restriction endonucleases sites are underlined in primers.
2 结果(Results)
2.1 构建同源重组质粒pSL4
根据E.
coli K12 tyrR序列(GenBank No: M12114.1)设计引物, 分两段PCR扩增tyrR编码区：
tyrR 前导区(编码区5′端约600
bp片段)和tyrR尾部(编码区3′端约1200
bp片段)。
将tyrR前导区、 tyrR尾部、
kan2(pJN0上带有kanR基因的DNA片段)和质粒pBR322拼接构成同源重组质粒pSL4(图1)。
Fig.1 Structure of plasmid pSL4
ampR,
ampicillin resistance gene; kanR, kanamycin resistance gene; kan2, DNA sequence
containing kanR.
2.2 筛选tyrR同源重组子
选用基因型为recA+的E. coli CSH60-31作为同源重组的出发菌株, 该菌株具有一定合成苯丙氨酸的能力, 利于检测tyrR基因剔除前后苯丙氨酸生物合成的变化情况。 pSL4转化E. coli CSH60-31后, 质粒上tyrR前导区和tyrR尾部片段将与染色体tyrR基因相应的同源区段发生双交换同源重组, 重组后在大肠杆菌染色体DNA的tyrR基因座位上将出现顺序为“tyrR转录调控区-tyrR
前导区-kan2-tyrR尾部-tyrR下游序列”的DNA序列(图2)。
筛选到的ampS kanR菌落命名为E. coli SL10。
连续传120代后, LB和含Kan的LB培养基中kanR抗性菌落数分别为1.48×1012个/L和1.44×1012个/L,
表明无选择压力时E. coli SL10的Kan抗性标记稳定,
同源重组的结果稳定。
Fig.2 Homologous recombination between
pSL4 and E.coli CSH60-31 chromosomal DNA
Double-cross homologous recombination
between pSL4 and E.coli CSH60-31 chromosomal DNA results in a new plasmid pSL5
and the new sequence of chromosomal DNA, “tyrR
regulation region-tyrR leader-kan2-tyrR tail-tyrR downstream sequence”.
ZHA fragment of chromosome contains a part of tyrR regulation region, tyrR
leader and a part of 5′
end of kan2. ZHB fragment includes a part of 3′
end of kan2, tyrR tail and the sequence following tyrR gene. ZHA and ZHB were
sequenced to confirm the validity of recombinant.
2.3 tyrR同源重组的验证
获得稳定的重组子E.
coli SL10后, 需要进一步证明： ⑴ 同源重组发生在E.
coli CSH60-31染色体tyrR基因座位上; ⑵ 同源重组的机制为双交换, 而非单交换;
⑶ tyrR基因被剔除, TyrR蛋白的正常功能消失。
2.3.1 游离质粒抽提与筛选标记分析 同源重组后将产生质粒pSL5
(图2)。
pSL4和pSL5的存在将干扰同源重组子的稳定性, 因此,
希望它们在无选择压力的情况下自然丢失。 采取的主要措施是：
延长转化中温育的时间至3 h; 使用Kan单抗平板作为转化液的筛选平板。
为调查E. coli SL10中是否仍然存在游离质粒, 验证如下： ⑴
浓缩E. coli SL10质粒抽提物, 电泳检测未发现质粒;
⑵ PCR扩增pSL4和pSL5特有的450 bp重组无关序列SEQ450,
结果表明, 无法在E. coli SL10中使用PCR扩增获得SEQ450;
⑶ E. coli SL10的选择标记为ampS kanR, 而pSL4和pSL5质粒都没有这种双重标记。
因此可以认定E. coli SL10中pSL4和pSL5不存在。
2.3.2 tyrR同源重组的DNA测序结果 根据tyrR序列(GenBank No: M12114.1)设计引物, 相同条件下只能在E.
coli K12和E. coli CSH60-31的染色体模板中扩增获得tyrR序列,
而无法从E. coli SL10中获得, 说明E.
coli SL10染色体上的tyrR基因已经被破坏。
如图2, 从E. coli SL10染色体DNA上扩增片段ZHA(1.8
kb)和 ZHB(1.3 kb), 克隆并测序。 结果表明ZHA和ZHB的整体结构与预计的重组结果基本相符, 测序和预计结果的同源性分别为98％(ZHA)和99％(ZHB)。 由此可得结论： 在E. coli CSH60-31染色体tyrR基因座位上发生了双交换同源重组, 而非单交换。
2.4 剔除tyrR基因对苯丙氨酸生物合成中关键酶的影响
大肠杆菌苯丙氨酸生物合成途径中有两个关键酶受TyrR调控： 由aroG编码的DAHPS和由tyrB编码的AT。
分别测定E. coli CSH60-31(对照菌)和E.
coli SL10(工程菌)中两种酶活性(表3),结果是工程菌中DAHPS和AT的活力比对照菌分别提高了1.08倍和2.70倍。
Table 3 Activities of DAHPS and AT in E. coli CSH60-31
and E. coli SL10
|
Enzymes |
E. coli CSH60-31 |
E. coli SL10 |
Relative special activities c |
|
AT a |
2.3 g/(g cells) |
6.2 g/(g cells) |
2.70 |
|
DAHPSb |
0.240 (A549) |
0.260 (A549) |
1.08 |
a
The amount of phenolpyrvunate converted to phenylalanine per microgram of dry
cells; b The absorbance measured by spectrophotometer at wavelength
549 nm; c The activities of enzymes in E. coli SL10 compared with
that of E. coli CSH60-31.
大肠杆菌aroP基因编码一种跨质膜双向运输芳香族氨基酸的通透酶(general aromatic amino acid
permease), 是大肠杆菌芳香族氨基酸非特异性运输途径中的关键环节, 其转录也受TyrR蛋白控制[6,25]。
根据E. coli K12 aroP序列(GenBank U87285)设计引物, PCR扩增具有自身调控序列的aroP基因,称为aroP(P),
再将其克隆到载体pBR322上, 构成质粒pBP。
分别以对照菌CSH60-31和工程菌 SL10为受体转化质粒pBP;
测定CSH60-31、 CSH60-31/pBP、 SL10和SL10/pBP四种菌株30 min吸收苯丙氨酸的量(表4)
Table 4 Phenylalanine was absorbed by the strains in 30 minutes
|
Strains |
Absorbance (g)a |
Increment (%) |
|
E. coli CSH60-31 |
7.447 |
100 |
|
E. coli CSH60-31/pBP |
7.886 |
105.9 |
|
E. coli SL10 |
11.645 |
100 |
|
E. coli SL10/pBP |
19.823 |
170.2 |
aPer
gram dry weight of the strains.
同样引入aroP(P)基因, 菌株CSH60-31/pBP的吸收量只提高5.9%, 而菌株SL10/pBP则提高70.2%, 说明在E.
coli SL10中tyrR基因失活, aroP(P)的阻遏被解除,
AroP的表达量增加, 苯丙氨酸吸收(运输)能力增强。
2.5 剔除tyrR基因对苯丙氨酸生物合成的影响
LB活化菌种过夜,
按10％接种量接入20 mL发酵培养基,
37 ℃ 250 r/min摇床培养48 h, 用苯丙氨酸脱氨酶法测定发酵液中苯丙氨酸含量(表5),
剔除tyrR基因的SL10菌株发酵生产苯丙氨酸的能力是原菌株的1.59倍。
Table 5 Outputs of phenylalanine in fermentation broth
|
Batch |
Yields of phenylalanine
(g/L) |
|
|
CSH60-31 |
E. coli SL10 |
|
|
1 |
0.734 |
1.297 |
|
2 |
0.952 |
1.340 |
|
3 |
0.704 |
1.167 |
|
Average |
0.797 |
1.268 |
2.6 正常TyrR蛋白调控功能的检测
构建了用于检测TyrR活性的4种质粒pBAL、 pBBL、
pBRL和pBGL, 统称为pBXL(图3)。
这些质粒上报告基因lacZ的转录分别使用aroP、
tyrB、 tyrR、 aroG的转录启动区(P),
因而都受TyrR蛋白的调控。 分别测定各工程菌株在MM培养基, 含1
mmol/L酪氨酸的MM培养基, 含1
mmol/L苯丙氨酸的MM培养基中的β-半乳糖苷酶活性,
结果列于表6。
TyrR蛋白对aroP和tyrB转录的抑制需要酪氨酸诱导,
所以在没有酪氨酸的培养基中CSH60-31
Fig.3 Diagram of pBXL using to verify
the TyrR activity
B, pBR322; L, lacZ gene coding region; X,
regulation regions of the genes whose transcription are regulated by TyrR. In “X”,
following genes are queued: P, aroP regulation region belonging to pBPL; B,
tyrB regulation region belonging to pBBL; R, tyrR regulation region belonging
to pBRL; G, aroG regulation region belonging to pBGL.
Table 6 Assay of TyrR regulation function with reporter gene
lacZ
|
Strains /Plasmids |
UlacZ |
||
|
MM |
MM+tyrosine |
MM+phenylalanine |
|
|
E. coli CSH60-31 |
1.72 |
2.13 |
1.47 |
|
E. coli SL 10 |
2.93 |
4.55 |
1.38 |
|
E. coli CSH60-31/pBAL |
341 |
5.88 |
3.80 |
|
E. coli SL 10/pBAL |
381 |
422 |
444 |
|
E. coli CSH60-31/pBBL |
852 |
14.70 |
795 |
|
E. coli SL 10/pBBL |
953 |
1056 |
1110 |
|
E. coli CSH60-31/pBRL |
4.60 |
5.06 |
2.94 |
|
E. coli SL 10/pBRL |
914 |
1012 |
1065 |
|
E. coli CSH60-31/pBGL |
5.38 |
5.24 |
5.59 |
|
E. coli SL 10/pBGL |
873 |
913 |
1114 |
和SL10菌株对质粒上lacZ基因表达的影响相当,
而在有酪氨酸的培养基中SL10菌株内lacZ基因表达明显高于CSH60-31菌株; TyrR蛋白对aroG和tyrR转录的抑制不需要酪氨酸诱导, 苯丙氨酸对aroG的转录略有抑制作用, 所以在各培养基中SL10菌株内lacZ基因表达明显高于CSH60-31菌株, 而pBGL在有苯丙氨酸存在时β-半乳糖苷酶活性提高更多一些。
从pBAL和pBBL的结果来看,
在SL10菌株中, 苯丙氨酸介导的TyrR对aroP和tyrB的抑制作用也消失了。 由此可以得出结论：
在tyrR基因被剔除的SL10菌株内,
TyrR蛋白阻遏aroP、 tyrB、
tyrR、 aroG转录的功能消失了。
3 讨论(Discussion)
从基因转录控制角度研究TyrR调控特性是芳香族氨基酸合成代谢调控的热点问题, 也为高产菌种选育提供了新的思路。 我们根据双交换同源重组的机制, 定点突变了大肠杆菌染色体上的tyrR基因; 通过比较重组后染色体tyrR基因座位的预计结构与实际结果, 从DNA序列结构角度验证了重组子和实验结果的可靠性; 利用报告基因lacZ证实了重组子中不再存在有活性的TyrR蛋白。 在定点突变获得的突变菌株中, 染色体上其他序列不受影响, 这为调控机制的深入研究提供了可靠且必要的研究材料。
在本工作中,
我们研究了tyrR基因突变前后, 苯丙氨酸合成途径中关键酶活力和苯丙氨酸发酵产量的变化情况。 结果表明： tyrR基因突变后, 受TyrR调控的关键酶(DAHPS, AT)的活力均有所提高,
但提高幅度不大; 突变菌株苯丙氨酸发酵产量仅有少量增加。 由此可见,
高产菌种的选育不是单靠突变tyrR基因就能实现。 TyrR蛋白的功能具有两重性：
一方面由于它的调控或它参与的调控系统使得菌体苯丙氨酸的合成量处于恰好满足维持正常生长和代谢所需的稳定状态, 另一方面它可能还有其他虽与苯丙氨酸合成无关, 但又是重要的生理功能, 或对于苯丙氨酸产量性状有正向促进作用。
已有报道TyrR蛋白促进tyrP和mtr基因的转录, 这两个基因编码芳香族氨基酸通透酶, 功能为跨质膜运输酪氨酸或色氨酸, 所以tyrR基因的失活必定影响氨基酸向胞外分泌。
值得一提的是试验表明tyrR基因失活后, 受其调控的aroP基因编码的另一种芳香族氨基酸通透酶活性增加, 这说明存在特异性和非特异性芳香族氨基酸运输系统, TyrR蛋白在这些运输系统之间起到一定的协调作用。 TyrR调控系统只是苯丙氨酸诸多已知及未知调控系统中的一种, 仅仅它的活性状态改变不太可能很大程度上影响苯丙氨酸的产量和合成途径中关键酶的活力状况。
在利用lacZ基因作为报告基因研究TyrR的活性中,
发现在有苯丙氨酸存在的情况下, 菌株E. coli SL10/pBAL的β-半乳糖苷酶活性显著高于菌株E. coli CSH60-31/pBAL。 这表明苯丙氨酸可以诱导TyrR蛋白抑制aroP的表达, 这一现象未见报道。
剔除大肠杆菌染色体上tyrR基因, 获得tyrR功能丧失并携带选择标记的突变型。 这些工作和实验材料的积累,
为我们进一步研究芳香氨基酸合成中TyrR调控机制奠定了基础。
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